吖啶酯化学发光免疫分析试剂产品
一、市场及技术的可行性分析
据统计，现在临床诊断试剂已发展成为一个拥有200亿美元国际市场、50亿元人民币左右的国内市场、年增长达到3%～5%的朝阳产业。我国的诊断试剂产业正面临一个高速发展的阶段，根据专家估计,未来5年国内临床诊断市场的年增长率高达15％～20％。目前我国列入生物制品规程的诊断试剂只有62个，同国际上的几百种产品相比，国内市场还远没有得到开发。同时随着人们生活水平的提高、随着人们对诊断试剂在预防与治疗疾病过程中重要性认识的增加和国家医疗体制的改革，市场规模必然会进一步扩大。因此，国内临床诊断产业将因此迎来很大的发展机遇，同时也是处于发展的关键时期。面对巨大的发展机会和日益严重的竞争，国内企业的发展策略宜实施以自主创新为宗旨，以市场为导向，采取横向或纵向联合的方式，开发具有自主知识产权的诊断试剂与自动化仪器，迅速大幅度提升我国临床诊断试剂产业的国产能力和国际竞争能力。
当前诊断试剂总体发展呈现的一个主要特点是免疫分析试剂的市场越来越大,并将会逐渐取代临床化学试剂，成为诊断试剂发展的主流。目前市场上已有的免疫分析试剂包括放免、金标、酶标、荧光和化学发光等。在这些试剂中，化学发光免疫分析试剂（或者说化学发光免疫分析方法（CLIA）具有检测灵敏度高；标记物稳定、试剂盒有效期长；不需要激发光源、仪器设备简单；线性范围宽；受外界的干扰因素少、信噪比高；成本低和易实现全自动化等优点。是免疫试剂的重要发展方向之一,其技术及应用在近十多年来得到迅猛的发展，也是目前发展和推广应用最快的免疫分析方法和试剂。目前国内三甲以上医院的检验科(包括血液科)所采用的体外诊断方法主要是化学发光免疫分析法。并且随着国内自主知识产权的化学发光试剂盒及化学发光仪器的开发与利用，将来三甲以下的医院也将逐步使用化学发光免疫分析试剂盒，替代现有的放免、酶标等而成为市场的主流。因此，化学发光试剂（发光底物）、化学发光免疫分析试剂盒及仪器的开发具有不可估量的市场前景。国外目前有多种商业化的CLIA系统，这些商业化系统都是封闭式全自动化学发光免疫分析仪及与之配套的试剂盒，最主要的如：Ciba Corning公司的Magic Lite System；Behring公司的Berilux System；Amersham公司的Amerlite System；DPC公司的Immulite System； Bochringer Mannheim公司的Elesys System, Beckman coulter 公司的ACCESS System等，国际知名公司如拜耳、罗氏、贝克曼、强生、DPC等。而我国对化学发光免疫分析的研究及仪器与试剂生产还相对比较落后，到目前为止还没有配套的全自动化学发光仪与相应的系列试剂盒。其原因一是由于我国化学发光免疫分析的研究起步较晚，二是发展较为缓慢。而发展缓慢的原因一是我国对仪器的基础技术和制造工艺水平不够，特别是高精度加工技术不高。二是大多数化学发光试剂的原料或受国外专利保护，或制造难度大，从国外购买的价格昂贵。目前，我国市场，特别是大型医院所用到的化学发光免疫分析仪器与试剂几乎被国外的公司所垄断。因此，我国急需研究开发符合国内条件及需要、生产成本低、价格低、有市场竞争力的化学发光试剂、化学发光免疫分析试剂盒及仪器，特别是配套的全自动化分析仪及系列化试剂盒。
目前应用于CLIA的化学发光体系有多种，最主要的有：鲁米诺（或异鲁米诺及其衍生物），吖啶酯（或吖啶磺酰胺），螺旋金刚烷-1,2-二氧乙烷及其衍生物和电化学发光体系等。其次还有咪唑类化合物、芳香草酸酯、黄嘌呤类化合物、葡萄糖氧化酶等。目前市场上应用的化学发光免疫分析试剂所采用的体系主要是前四种，而在这四种体系中，鲁米诺（或异鲁米诺及其衍生物）体系的灵敏度相对后三种低且稳定性差，后三种发光体系的灵敏度都很高并基本相当。其中吖啶酯（或吖啶磺酰胺）发光体系具有非常独特的优点，一是发光体系相对最简单，不需要催化剂和增强剂，在碱性H2O2溶液中就可以直接发光；二是由于不用催化剂和增强剂，受干扰因素少，本底低，信噪比高。三是发光为flash型，发光快速集中，发光强度大，检测快速，检测灵敏度高，精密度高；四是发光标记物稳定，试剂盒有效期长，而且标记简单；五是成本低；六是对仪器要求简单，易实现全自动化。基于吖啶酯发光体系具有的独特优点，研发吖啶酯类化学发光免疫分析系列试剂盒及配套仪器，从理论与实际意义上讲是切实可行的。
目前国际上应用于化学发光免疫分析临床诊断试剂盒所采用的吖啶酯为AE·NHS [4-(2-Succinimidyloxycarbonylethyl) phenyl-10methylacridinium-9-carboxylate fluorosulfonate] 和DMAE·NHS[2’,6’-Dimethyl-4’-(N-Succinimidyloxycarbonyl)Phenyl-10-Methyl-Acridinium-9-Carboxylate Methosulfate]。AE·NHS易水解、热稳定性不好。 DMAE·NHS的分子结构的酚环上连有两个甲基，空间位阻大，水解稳定性好，它的光量子产率与AE·NHS相当，但其水解稳定性、热稳定性和信噪比均较AE·NHS高。我们以前的研究结果表明，室温下，DMAE·NHS在pH为5.8, 7.0, 8.0的PB缓冲液中， 16天后其发光活性只分别降低1.6%、3.6%和8.3%，在4℃或冰冻条件下, DMAE·NHS在pH为 7.0 的0.1mol/L PB缓冲液中， 保存半年后，其发光活性没有下降。DMAE·NHS与蛋白的偶联物同样具有相当好的稳定性。DMAE·NHS应用于化学发光免疫分析商业试剂盒已取得巨大成功，如Ciba Corning公司的Magic Lite化学发光免疫分析系列试剂盒及其配套的全自动化学发光免疫分析仪，就是使用DMAE·NHS做发光标记物，它目前有几十个免疫分析试剂盒。但目前国内的企业，由于技术上的原因，尚未有成规模的商业化的用于临床诊断的吖啶酯化学发光免疫分析试剂盒及配套的化学发光免疫分析仪。而且现在从市场上能买到的商品化吖啶酯只有AE·NHS（价格昂贵），没有DMAE·NHS。而要开发临床诊断试剂盒，只能选择性能好的DMAE·NHS，不能选择性能相对劣势的AE·NHS。
我们在国内首先独立掌握吖啶酯DMAE·NHS（包括AE·NHS）及其化学发光免疫分析试剂的研发技术，已申请国家发明专利。我们具备的技术包括吖啶酯的合成、标记、免疫分析方法的建立到最终试剂盒的生成等。我们从1999年开始从事化学发光免疫分析试剂盒的研究，已有近十的从事该领域研究工作的历史，曾对多种不同化学发光体系进行过研究，包括吖啶酯、鲁米诺、碱性磷酸酶、草酸酯等。尤其是做了大量的有关吖啶酯化学发光免疫分析的研究，这些研究取得了一些创新性成果, 比如我们首次在国内报导成功合成DMAE·NHS, 首次应用合成的DMAE·NHS作为发光标记物建立TSH和TT4的化学发光免疫分析试剂（此工作在中国原子能科学研究院完成），并发表多篇与之相关的研究论文及申请数项相关专利。除此之外，我们还做过许多其他方面与化学发光有关的研究工作，如毛细管电泳-化学发光联用技术分离检测氨基酸（此工作在美国完成），化学发光免疫分析检测兴奋剂蛋白质芯片及化学发光增强剂的合成（此工作在生物芯片北京国家工程研究中心完成），艾滋病p24抗原化学发光免疫分析试剂的研究（此工作在北京工业大学完成）等。这些相关的研究基础提供了技术保障。
二、技术路线
吖啶酯DMAE·NHS及其衍生物的合成可采用下列两条路线:
图：路线1
图：路线2
其中R1、R2、R3为取代基，X为官能团。路线1包括七个步骤，与国外的文献方法一致，路线2只有4个步骤，是我们对文献方法进行改进后设计的新合成路线，该方案缩短合成路径由七步到四步，可大大节省原料与时间，降低合成难度，提高产率。
除合成DMAE·NHS与AE·NHS外，我们还可以合成新的吖啶酯衍生物。我们在设计合成新的吖啶酯类化合物时可以从两个方面改进其结构以达到提高其发光效率和分析灵敏度之目的。一是根据吖啶酯类化合物的化学发光反应机理，从电子效应方面考虑，可采取在吖啶环上引入吸电子基团，如氰基、酯基、硝基等，从而降低吖啶环与吖啶环上C-9碳原子的电子密度，有利于过氧化氢离子的亲核进攻，降低激发态与基态之间的能级差，降低反应活化能，提高分子激发效率和发光效率，加快反应速度。从空间效应考虑，应减少化合物的空间位阻，在吖啶环和苯氧环上尽量引入小基团的取代基。二是增大其水溶性，从而增大分子碰撞几率和反应分子数，进而提高发光反应效率和发光强度。为增大化合物的水溶性，一方面在合成的最后一步连接能增加化合物水溶性的官能团，另一方面，可在吖啶环上引入亲水基团，如磺酸基等。我们推断通过这两方面的改进，吖啶酯的发光效率会得到进一步提高，超越已有吖啶酯类化合物。这是我们根据反应机理和前面研究结果提出的新思路。
吖啶酯的标记简单易行，可采用琥珀酰亚胺修饰的吖啶酯与蛋白质氨基共价键连接形成酰胺键的方法，在碱性缓冲液中进行标记，标记的蛋白质与游离吖啶酯的分离纯化可采用Sephadex G-50 凝胶柱层析法。
吖啶酯化学发光免疫分析方法的建立及试剂盒的生成，从原理与方法上讲与其它标记免疫分析方法类似，如免疫分析方法可采用夹心法或竞争法，可引入生物素-链亲和素放大分离系统，固相材料可用96孔板或试管等。最后试剂盒的生成所需要的方法学参数包括检测灵敏度、标准曲线、线性范围、准确度、精密度（包括批内、批间变异）、健全性及与其它方法的相关性、内标、有效期等。
纵上所述，开发吖啶酯类化学发光免疫分析试剂盒，关键技术是吖啶酯的合成，而此关键技术我们已完全掌握且有自已的专利，而且与之相关的化学发光免疫分析技术我们很熟悉，因此在技术上是切实可行的，不存在风险。
需求资金：报价底价180万元（正好够科研、试制、实验费用，半年可做出稳定的批量产品），无任何弹性。合作方式：投资合作方式为主。
虫洞（北京）卫生科技有限公司 戴天岩 经理
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